卡那霉素酶聯(lián)免疫試劑盒說明書
藥物概述及檢測原理
卡那霉素是氨基糖甙類藥物，被廣范應(yīng)用于動物疾病的治療，由于其具有神經(jīng)毒性和腎臟毒性，歐美國家及我國均要求其*使用。
本公司的卡那霉素酶聯(lián)免疫試劑盒使用新一代生物技術(shù)開發(fā)，具有方便、快速、靈敏等特點。
本試劑盒利用卡那霉素抗體與卡那霉素可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，先在酶標板上預(yù)包被抗原，再加入標準品（樣本）和卡那霉素抗體工作液，樣本或標準品中的卡那霉素藥物與包被抗原競爭卡那霉素抗體，后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標準品（樣本）中卡那霉素藥物的含量成反比。
- 標準品工作液：0 ppb、0.2 ppb、0.6 ppb、1.8ppb、5.4 ppb、16.2ppb，
- 1 mL/瓶。
- 96孔酶標板：1塊
- 卡那霉素抗體工作液：1瓶（7mL/瓶）
- 酶標二抗工作液：1瓶（7mL/瓶）
- 20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）
- 20×濃縮組織復(fù)溶液：1瓶（10 mL/瓶）
- 10×濃縮蜂蜜復(fù)溶液：1瓶（10 mL/瓶）
- 底物A液：1瓶（7 mL/瓶）
- 底物B液：1瓶（7 mL/瓶）
- 終止液：1瓶（7mL）
- 說明書
- 蓋板膜
儀器：
- 酶標儀（檢測波長450 nm、630 nm）
- 電子天平（精度：0.01 g）
- 離心機（4000 g及以上）
- 生化培養(yǎng)箱（可調(diào)25℃）
- 搖床
- 旋渦振蕩器
- 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）
- 計時器
試劑：（試劑均為分析純）
- 氫氧化鈉
- 氯化鈉
- 氯化甲鉀
- 磷酸二氫鉀
- 十二水合磷酸氫二鈉
- 去離子水
試劑盒與其他藥物的交叉反應(yīng)率：
- 卡那霉素………………………100%
- 大觀霉素、鏈霉素、替米考星…＜0.1%
- 工作液準備
- 組織復(fù)溶工作液：取1份20×濃縮組織復(fù)溶液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
- 蜂蜜復(fù)溶工作液：取1份10×濃縮蜂蜜復(fù)溶液加去離子水9份按照1:9的比例稀釋即得。
- 緩沖液: 0.1M PBS溶液(PH=10-11) 稱取13.4g十二水合磷酸氫二鈉.20g氯化鈉.0.32g氫氧化鈉.0.5g磷酸二氫鉀.0.5g氯化甲鉀加去離子水溶解定溶至500ml。
- 1 M鹽酸溶液：量取1ml濃鹽酸加去離子水11ml溶解混勻即得。
- 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
- 樣品前處理
組織（雞肉、豬肉）（稀釋倍數(shù)：20）
- 稱取1.0±0.05g均質(zhì)樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入3ml緩沖液（見配液5.1），上下顛倒振搖5min；
- 放入60℃水浴環(huán)境中60min后，取出4000g以上，室溫離心10min；
- 移取上清液100ul，加入400ul組織復(fù)溶工作液（見5.1）中渦旋20s；
- 取50ul用于分析。
蜂蜜（稀釋倍數(shù)：15）
- 稱取1.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml塑料離心管中；
- 加入2ml 去離子水，強烈震搖2min （或使用渦動儀渦動1min）；
- 取100μL上清液至400μL蜂蜜復(fù)溶工作液（見5.1）中，充分渦動30s；
- 取50 μL液體進行分析。
液態(tài)奶樣本方法一（稀釋倍數(shù)：10）（同四環(huán)素液態(tài)奶方
法一致）
- 將采樣好的液態(tài)奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；
- 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；
- 加入50μL 1M鹽酸（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；
- 使用離心機室溫4000 g以上離心10 min；
- 取上層清亮液體50μL加入另一干凈離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油），再加入450μL組織復(fù)溶工作液（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；
- 取50 μL液體進行分析。
液態(tài)奶樣本方法二（稀釋倍數(shù)：40）（同四環(huán)素液態(tài)奶方法
一致）
- 量取50ul液態(tài)奶樣品于1950ul組織復(fù)溶工作液（見5.1）中；
- 充分渦動1 min混勻；
- 立即取50ul進行檢測。
- 檢測
- 準備：將要使用的酶標板條插入酶標板架上，并記錄各標準品和樣品的位置，為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗（每個樣本/標準品點兩孔），未使用的酶標板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環(huán)境中以防變質(zhì)；
- 加樣：向?qū)?yīng)微孔中加入標準品工作液/樣品溶液50 μL，向每孔中加入50 μL酶標二抗工作液，再向每孔中加入50 μL抗體工作液，；
- 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)20 min；
- 洗滌：取出酶標板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復(fù)洗滌3~4次后，將酶標板倒置于吸水紙上，用力拍干；
- 顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內(nèi)使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質(zhì)失效）；
- 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)10 min；
- 終止：在反應(yīng)后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍變黃表明終止成功。
- 讀數(shù)：終止后的酶標板應(yīng)在5 min內(nèi)用酶標儀讀數(shù)，建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標板吸光度值。
- 計算結(jié)果
- 設(shè)各標準品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標準（濃度為0 ppb的標準品）吸光度平均值B0以(B/B0)×100%為各標準品（或樣品）對應(yīng)的吸光度的百分比：
- 使用半對數(shù)系統(tǒng)代入標準品對應(yīng)的吸光度的百分比，與標準品濃度擬合出標準曲線。
- 將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中，即可得出樣品對應(yīng)的濃度，后乘以樣品相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中檢測物含量。
- 試劑盒靈敏度：0.2 ppb；
- 標準曲線范圍：0.2 ppb-16.2 ppb；
- 板內(nèi)變異系數(shù)：<5%；
- 板間變異系數(shù)：<15%；
- B0吸光度理想值：>0.8；
- 回收率：90%±30%
- 樣品低檢測限：
豬肉、雞肉…………約6ppb
蜂蜜…………………約5ppb
液態(tài)奶樣本方法一…約5ppb
液態(tài)奶樣本方法二約10ppb
注：ppb=ng/mL或ng/g。
本試劑盒為定量或半定量試劑盒，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結(jié)果為陽性，建議使用儀器方法開展確證實驗（如GC/MS、LC-MS/MS等）。
- 試劑盒貯存溫度為2-8℃，切勿凍存。
- 未使用完的酶標板條須密封保存2-8℃的環(huán)境中。
- 使用試劑盒前，請務(wù)必仔細閱讀說明書。
- 試劑盒使用前，需將盒內(nèi)各組份置于實驗臺上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。
- 試劑在使用前許搖勻，混合時應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡。
- 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染，檢測過程中所用槍頭不得重復(fù)使用。
- 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。
- 樣品處理完畢后請立即分析，否則可能影響檢測結(jié)果。
- 底物A液、底物B液均為無色透明液體，若在使用前已變成藍色，或混合后立即變藍，說明試劑已污染或變質(zhì)。
- 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應(yīng)時間差對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。
- 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水沖洗。若不慎濺入眼，請在*清洗后去醫(yī)院檢查。
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